Pewarnaan Gram

Reagens Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram termasuk pewarnaan differensial karena dapat digunakan untuk membedakan bakteri dalam dua kelompok besar yaitu Gram positif dan Gram negatif. Pada praktikum ini digunakan bakteri L. Achidophilus, E. coli, Lactococcus sp.

Pemberian kristal violet pada bakteri Gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan Gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri Gram positif mengandung protein dan Gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri Gram negatif sedangkan pada bakteri Gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Perbedaan dasar antara bakteri Gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri Gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan ini adalah fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV (warna utama) iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada Gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa spesies yang memang bersifat gram variable seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. 

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

 a.  Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

b.  Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009)

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif. Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-) Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-4%) Kandungan lipid tinggi Ketahanan terhadap penisilin Lebih sensitif Lebih tahan Penghambatan oleh pewarna basa (VK) Lebih dihambat Kurang dihambat Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif kompleks Relatif sederhana Ketahanaa terhadap perlakuan fisik Lebih tahan Kurang tahan

Bakteri merupakan mikrobia prokariotik uniselular, termasuk klas Schizomycetes, berkembang biak secara aseksual dengan pembelahan sel. Bakteri tidak berklorofil kecuali beberapa yang bersifat fotosintetik. Cara hidup bakteri ada yang dapat hidup bebas, parasitik, saprofitik, patogen pada manusia, hewan dan tumbuhan. Habitatnya tersebar luas di alam, dalam tanah, atmosfer (sampai 10 km diatas bumi), di dalam lumpur, dan di laut. Bakteri mempunyai bentuk dasar bulat, batang, dan lengkung. Umumnya bakteri berukuran 0,5-10 µm. 

Para ahli menggolongkan struktur bakteri menjadi dinding luar, sitoplasma, dan bahan inti. Bakteri memiliki flagel atau bulu cambuk, pili atau fimbriae, kapsula atau lapisan lendir, dinding sel dimana ada yang struktur dinding sel bakteri Gram Negatif yaitu merupakan struktur yang berlapis, sedangkan bakteri Gram Positif mempunyai satu lapis yang tebal. Dalam sel baktri terdapat membran sitoplasma, protoplasma, inti, organel-organel lain yang memiliki peran masing-masing. Bila bakteri tumbuh di dalam medium yang tidak cair, maka terjadilah suatu kelompok yang dinamakan koloni. Bentuk koloni berbeda-beda untuk setiap spesies, dan bentuk itu merupakan ciri khas bagi suatu spesies tertentu. Pengamatan bakteri dapat kita lakukan secara individual, satu persatu, maupun secara kelompok dalam bentuk koloni, dan sifat-sifatnya dapat kita ketahui melalui koloni yang tumbuh di medium permukaannya (Puspita, 2008).

Isolat bakteri yang diperoleh diamati morfologi koloni dengan melihat bentuk koloni, warna, tepian dan elevasi pada medium agar lempeng, agar tegak dan agar miring. Sedangkan morfologi sel ditentukan dengan melihat olesan biakan yang sudah diwarnai dibawah mikroskop dan melihat bagaimana bentuk sel, sifat gram, dan kemampuan membentuk spora dari bakteri tersebut (Pelczar dan Chan, 2006).

Bakteri hidup sukar untuk dilihat dengan mikroskop cahaya biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri-sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud bakteri terwarnai adalah organisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari. Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran (Volk, 1993).

Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1980).

Cara pewarnaan hanyalah dengan menambahkan pada olesan yang telah difiksasi dengan zat pewarna khusus. Zat pewarna tersebut adalah pewarna diferensial, karena dapat membagi bakteri sejati menjadi dua kelompok fisiologi, dengan demikian sangat memudahkan identifikasi jenisnya. Prosedur pewarnaan ini terdiri atas empat langkah, yaitu olesan dibasahi dengan lembayung gentian atau lembayung kristal, setelah 60 detik zat pewarna lembayung dibilas dan olesan dibasahi dengan larutan yodium. 60 detik kemudian, yodium dibilas dan gelas preparat dicuci dengan larutan alkohol 95 % selama 15-30 detik, lalu gelas preparat selama 30 detik diwarnai dengan safranin (zat pewarna merah) atau coklat Bismarck (dipakai bagi orang yang buta warna terhadap warna merah). Setelah spesimen yang diwarnai itu ditemukan dengan obyektif tinggi-kering, dapatlah diamati dengan imersi minyak, dengan meneteskan minyak langsung pada olesan terwarnai dan menurunkan lensa obyektif imersi minyak ke dalam minyak (Volk, 1993).

Pengecatan diferensial mengunakan dua warna yang kontras untuk membedakan antara jenis organisme yang berbeda. Empat bahan reaksi yang digunakan untuk pewarnaan Gram yaitu : 

1. Crystal violet, pewarna pertama ( warna ungu). 
2. Iodine, pewarna untuk mempertajam pewarna pewarna pertama (suatu kompleks dengan crystal violet). 
3. Ethanol 96%, penghilang warna
4. Safranin (Air Fuchsin), suatu counterstain.(Sujudi, 1993).