A.
Latar
Belakang
Penyakit
Tuberkulosis (TB) paru adalah suatu penyakit infeksi, penyakit kronis, penyakit
menular langsung, yang dapat menyerang siapa saja terutama mereka yang tinggal
di dalam rumah yang lembab dan ventilasi udara yang tidak baik serta
orang-orang yang daya tahan tubuhnya rendah. Tuberkulosis terutama menyerang
paru-paru, dan juga dapat menyerang organ lain diluar paru dikenal sebagai TB
ekstra paru.
Penyakit Tuberculosis (TBC)
adalah penyakit infeksi menahun /kronis
yang disebabkan oleh Mycobacterium
tuberculosis, yang dapat menyerang
semua organ terutama paru-paru (80%),
dapat juga menyerang organ seperti pleura, selaput otak, selaput jantung,
kelenjar limfe, tulang/persendihan, kulit, usus, ginjal saluran kencing, alat
kelamin, dan lain-lain. Infeksi dapat bersifat silent, latent atau aktif,
dengan masa pengobatan 6 sampai 8 bulan, bahkan bisa lebih dari 1 tahun.
Kuman Mycobacterium tuberculosis berpindah dari satu orang ke orang lain
melalui batuk atau bersin
Sampai sekarang diagnosis laboratorik penyakit Tuberculosis masih merupakan masalah penting di Indonesia.
Diagnosis tuberculosis secara laboratorium dapat ditegakkan dengan
ditemukannya basil tahan asam (BTA) baik
melalui pemeriksaan mikroskopis, kultur atau Polimerase Chain Reacsion (PCR). BTA merupakan kuman Mycobacterium tuberculosis yang
berbentuk batang lurus atau agak bengkok dan bersifat tahan terhadap
penghilangan zat warna dengan asam alcohol.
Pada
identifikasi M. tuberculosis,
pemeriksaan dengan media biakan lebih sensitif dibandingkan dengan pemeriksaan
mikroskopis. Pemeriksaan biakan dapat mendeteksi 10 – 1000 mycobacterium/ml.
Tidak
semua basil tahan asam yang diasingkan
Lowenstein-Jensen atau Ogawa adalah Mycobacterium tuberculosis. Perlu dilakukan
diindentifikasi lebih lengkap untuk membedakan spesies. Dasar dari pemeriksaan
identifikasi adalah waktu pertumbuhan, pembentukan pigmen, tes biokimia dan
suhu pertumbuhan.
Fujiko
(2002) dan Aditama (2004) menyatakan bahwa ciri-ciri utama Mycobacterium dan kelompok MOTT (Mycobacterium other than
tuberculosis) / kelompok runyon di media Ogawa adalah ada media Ogawa
menunjukan sifatnya yang kering, rapuh, permukaan tidak rata, pertumbuhan
eugenik dan warna kekuning – kuningan. Ketahanan asamnya ada, tingkat
pertumbuhan lambat, pigmentasi lebih dari 99% negatif dan tes niasin lebih dari
90% positif.
Pemeriksaan
identifikasi dengan menggunakan media Ogawa ini memberikan sensitivitas dan
spesifisitas yang tinggi dan dipakai sebagai alat diagnostik pada program
penanggulangan TB. Identifikasi
mycobacterium dimulai dengan
menilai waktu pertumbuhan, warna pigmen, morfologi koloni dan hasil pewarnaaan
BTA.
Langkah
awal untuk identifikasi pada media padat adalah: Seleksi Koloni: Keberadaan
satu atau lebih jenis koloni diamati. Penampilan kasar, halus cembung, halus
menyebar, halus dengan tepi berkeriput, kasar transparan, kasar keruh dan
sebagainya dideskripsikan; Pigmen paska inkubasi di tempat gelap (kuning,
orange, kuning muda, kuning-orange) diamati. Jika tak berpigmen, sebut sebagai
”buff”; Jika terdapat lebih dari satu
jenis koloni, dilakukan subkultur untuk tiap jenis koloni dan diamati hal-hal
tersebut diatas.
Pewarnaan
BTA dengan Ziehl Neelsen. Meyakinkan tidak ada pencemaran. Kecepatan
pertumbuhan. Rapid grower akan tumbuh dalam 7 hari atau kurang,
sedangkan slow grower akan tumbuh setelah 7 hari (tidak selalu
jelas batasnya); Pencahayaan Mikobakterium yang termasuk photokromogen akan
menghasilkan pigmen jika dipaparkan cahaya. Namun pigmen hanya optimal jika
koloni kuman terpisah. Jika pertumbuhannya sangat padat, pigmen tak akan
muncul; Dilakukan uji biokimia tertentu
pada koloni murni.
Morfologi koloni
M. tuberculosis pada media Ogawa
adalah ebagai berikut: kasar, kering,
rapuh, tengah bertumpuk dengan tepi berjejas tipis; adang-kadang tipis dan
menyebar. Hari tumbuh 12 – 28 hari dan tidak berpigmen baik pada tempat
yang terang maupun gelap (buff).
Bila
terdapat kontaminasi pada kultur,
dilaporkan segera dan diulangi pembuatan kultur. Bila kultur positif dan pertumbuhan dinilai
sebagai M. tuberculosis, dilaporkan segera pada pihak yang berkepentingan. Pada
minggu ke 4 dapat dibuat laporan sementara. Pada minggu ke 8 dibuat laporan
akhir.
B.
Tujuan
Tujuan
dalam pemeriksaan BTA dengan cara kultur dan resitensi menggunakan media ogawa
3 % adalah untuk memberikan sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi pada
pemeriksaan Mycobacterium tuberculosis sehingga hasil pemeriksaan kuman
Mycobacterium tuberculosis dapat terlihat dengan baik dan benar.
C.
Metode
/ Prinsip
Bahan sputum
dipindahkan sebanyak 1 ml ke dalam tabung reaksi. dituangkan lebih kurang 4 ml
larutan NaOH 4%, simpan tabung tersebut dalam inkubator pada suhu 37oC selama 15 menit untuk melarutkan spesimen.
Kemudian diaduk
perlahan-lahan agar homogen. Dipipet 0,1 ml bahan pemeriksaan yang sudah
di olah pada dua buah tabung kultur/pembiakan yang berisi madia ogawa 3%,
menyebar rata di atas permukaan setiap media. Letakkan tabung-tabung pada rak
miring dengan tutup yang dikendorkan.
Simpan pembenihan yang sudah ditanami pada inkubator 37oC.
Tutuplah tabung dengan baik ketika permukaan media kering, kemudian inkubasi
sampai sekurang-kurangnya 4 minggu.
Amati koloni yang tumbuh, Mycobacterium tuberculosis positif jika pada permukaan media
terdapat pertumbuhan koloni yang berwarna kunung atau orange. Selanjutnya
koloni ini digunakan untuk pemeriksaan kultur dengan menggunakan bahan uji
D.
Pembuatan
Media Ogawa (Pra Analitik)
Media ogawa yang digunakan sebagai media
isolasi mycobacterium tuberculosis adalah Ogawa 3 % yang terdiri dari KH2PO4,
Monosedium glutamate, Gliserol malchiete green 2 % dan telur ayam segar.
1. Larutkan
zat-zat garam terlebih dahulu dan disterilkan 121 oC selama 30
menit, setelah didinginkan kemudian ditambahkan gliserol, malachiete green 2 %
dan telur ayam kemudian dihomogenkan.
2. Masukkan
Campuran tersebut diatas kedalam tabung Mc Cartney 14 ml
3. Dikoagulasikan
dengan menggunakan inspirator pada suhu 85 oC selama 45 menit pada
posisi miring/Slant.
4. Diamkan
sampai dingin dan simpan ditempat yang steril.
5. Media
siap untuk dipakai
E.
Alat
dan Bahan
1.
Alat
- Jas
Laboratorium
- Masker
- Sarung
Tangan (Handscund)
- Face
Shield/Goggles
- Mikroskop
- Inkubator
- Bunsen
- Rektal
Swab
- Vortex
- Pipet
2.
Bahan
- NaOH
4 %
- NaCL
- Ogawa
3 %
- PNB
- INH,
Rif, Eth, dan Pyrazinamid (P)
F.
Cara
Kerja (Analitik)
1.
Cara
Kerja Kultur
- Kumpulkan sputum penderita (sputum pagi)
lakukan homogenasi dan dekontaminasi dengan Natrium Hidroksida 4%, aduk selama
2 menit. Tindakan ini dilakukan untuk membunuh kuman lain selain Mycobacterium.
- Tambahkan NaCl fisiologis untuk pengenceran
dan aduk hingga rata, biarkan 30 menit.
- Dengan menggunakan pipet, ambil ± 2cc suspensi dan masukkan ke dalam media
Ogawa 3%.
- Inkubasi pada suhu 35ºC - 37°C dan hindarkan terkena cahaya matahari.
- Setelah di inkubasi 5 – 7 hari, media yang
telah ditanami mulai di baca dan catat hari pertama pertumbuhan koloni semenjak
penanaman.
- Jika setelah 8 minggu tidak terlihat
pertumbuhan maka kultur di anggap negatif dan boleh di buang.
2. Cara Kerja Resistensi
Untuk mendapatkan konsentrasi INH (0.1, 1.0, 5.0) dilakukan
prosedur berikut
- 1 mg INH dilarutkan dalam 10 ml Aquadest steril sehingga
didapatkan konsentrasi INH 100 ug/ml (larutan A).
- INH 0.1 ug : 0.1 ml larutan A (konsentrasi 100 ug/ml) +
100 ml medium.
- INH 1 ug : 1 ml
larutan A + 100 ml medium.
- INH 5 ug : 5 ml
larutan A + 100 ml medium.
Untuk mendapatkan konsentrasi Rifampicin (2.0, 10.0, 50.0
ug) dilakukan prosedur berikut :
- 10 mg Rifampicin dilarutkan dalam 10 ml Aquadest steril,
sehingga didapatkan konsentrasi Rifampicin 1000 ug/ml (larutan B).
- Rif 2.0 ug : 0.2
ml larutan B + 100 ml medium.
- Rif 10 ug : 1 ml
larutan B + 100 ml medium.
- Rif 50 ug : 5 ml
larutan B + 100 ml medium.
Untuk
mendapatkan konsentrasi Ethambutol (1.0, 5.0, 10.0 ug/ml) dilakukan prosedur
berikut :
- 10
mg Ethambutol dilarutkan dalam 10 ml Aquadest steril, sehingga didapatkan
konsentrasi Ethambutol 1000 ug/ml (larutan C).
- Eth 1.0 ug : 0.2
ml larutan C + 100 ml medium.
- Eth 5.0 ug : 0.5
ml larutan C + 100 ml medium.
- Eth 10 ug : 1 ml
larutan C + 100 ml medium.
Untuk
mendapatkan konsentrasi Pyrazinamid (30, 150, 750 ug/ml) dilakukan prosedur
berikut :
- 100
mg Pyrazinamid dilarutkan dalam 10 ml Aquadest steril, sehingga didapatkan
konsentrasi Ethambutol 10.000 ug/ml (larutan D).
- P 30 ug : 0.3
ml larutan D + 100 ml medium.
- P 150 ug : 1.5
ml larutan D + 100 ml medium.
- P 750 ug : 7.5
ml larutan D + 100 ml medium.
Suspensi Kuman
Suspensi kuman di buat dengan prosedur berikut :
- Ambil 1 o'se koloni kuman dari medium Ogawa 3% dan
masukkan ke dalam NaCl fisiologis, aduk hingga homogen, hingga dicapai
kekeruhan dengan standart Mc Farland I (larutan A).
- Lakukan pengenceran 1/1000, dengan cara mengambil 0.01 ml
larutan A dan masukkan ke dalam 10 ml NaCl fisiologis, sehingga didapatkan
kuman dengan konsentrasi pengenceran
1/1000 (larutan B), larutan ini akan digunakan sebagai kontrol.
- Untuk larutan obat, digunakan suspensi kuman dengan
pengenceran 1/100, di lakukan dengan cara mengambil 0.1 ml larutan A dan
masukkan ke dalam 10 ml NaCl fisiologis (larutan C).
- Pada medium kontrol,
masukkan 2 tetes suspensi kuman dengan konsentrasi 1/1000 (larutan B) dan pada
medium obat masukkan 2 tetes suspensi kuman dengan konsentrasi 1/100 (larutan
C).
- Lihat pertumbuhan kuman.
- Tingkat resistensi di
hitung berdasarkan perbandingan antara jumlah koloni yang tumbuh pada medium
kontrol dengan medium tanpa obat (metoda proporsional).
G.
Pengamatan
dan Pembacaan (Pasca Analitik)
Pada umumnya tanda pertumbuhan yang khas
dari Mycobacterium tuberculosis akan tampak dalam waktu 3-4 minggu. Koloninya
berwarna kuning muda, permukaan kering dan rapuh, dengan sudut yang tidak rata.
Pertumbuhan ini disebut eugenic.
Penegasan / kepastian tentang
Mycobacterium tuberculosis harus dilakukan dengan tes identifikasi
dengan media PNB.
- Kultur
diamati pada hari ke-7 untuk golongan yang tumbuhnya cepat dan pada minggu ke-4
untuk golongan yang tumbuh lambat.
- Koloni
yang tanpak pada media diperiksa dengan dibuat preparat dan diwarnai dengan
Ziehl Neelsen untuk memastikan BTA.
- Jika
sudah minggu ke-4 tidak terlihat adanya koloni dilanjutkan inkubasi selama 8
minggu sebelum hasilnya dinyatakan negatif.
H.
Pencatatan
dan Pelaporan Hasil (Interprestasi)
Pelaporan
dilakukan bukan hanya jumlah koloni yang tumbuh, tetapi juga bentuk tumbuhnya.
Menurut (Aditama & Luthni ,2002) pelaporan hasil biakan menurut WHO,
Technic Guide 67 adalah :
(-) : tidak ada pertumbuhan
(1+) : 1 –
200 koloni
(2+) : ½
dari media tertutup oleh 200 – 500 koloni
(3+) : ¾
dari media tertutup oleh hampir seluruh
koloni, 500 – 2000 koloni
(4+) :
media tertutup seluruhnya oleh koloni, lebih dari 2000 koloni
I.
Kesimpulan
1. Sampai sekarang diagnosis laboratorik penyakit Tuberculosis masih merupakan masalah penting di Indonesia.
Diagnosis tuberculosis secara laboratorium dapat ditegakkan dengan
ditemukannya basil tahan asam (BTA) baik
melalui pemeriksaan mikroskopis, kultur atau Polimerase Chain Reacsion (PCR).
2. Pemeriksaan
identifikasi dengan menggunakan media Ogawa ini memberikan sensitivitas dan
spesifisitas yang tinggi dan dipakai sebagai alat diagnostik pada program
penanggulangan TB.
3. Salah
satu kendala dalam diagnosis pasti tuberkulosis adalah lamanya waktu untuk
kultur atau pembiakan kuman tuberkulosis secara konvensional seperti biasa
dilakukan sekarang ini. Dalam perkembangan ada beberpa teknik baru yang dapat
mengidentifikasi pasti kuman tuberkulosssis secara lebih cepat. Salah satunya
yaitu reaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR).
4. Pemeriksaan kultur sangat dibutuhkan
untuk memastikan diagnosis pada kasus hasil apusan dahak negatif. Metode
tradisional yang biasa digunakan yaitu menggunakan medium padat seperti
Lowenstein-Jensen dan Ogawa. Namun terdapat bukti yang menunjukkan bahwa
pertumbuhan bakteri di medium padat pada umumnya lebih lambat dan kurang
sensitif dibandingkan medium cair sehingga dikembangkanlah sistem medium cair
seperti BACTEC
dan MGITT