Selamat Datang Di Milis Resmi Saya Semoga Bermanfaat Bagi Kita Semua Hablun Minallah Wa Hablun Minannas Setiap Langkah Harus Dengan Arti, Setiap Langkah Harus Dengan Pikiran, Sebelum Melakukan Harus Hati-Hati, Kalau Jelas Itu Jelek/Buruk Dijauhi

Tuberculosis Dan Kultur Sensivity Test


A.   Latar Belakang
Penyakit Tuberkulosis (TB) paru adalah suatu penyakit infeksi, penyakit kronis, penyakit menular langsung, yang dapat menyerang siapa saja terutama mereka yang tinggal di dalam rumah yang lembab dan ventilasi udara yang tidak baik serta orang-orang yang daya tahan tubuhnya rendah. Tuberkulosis terutama menyerang paru-paru, dan juga dapat menyerang organ lain diluar paru dikenal sebagai TB ekstra paru.
Penyakit Tuberculosis (TBC) adalah penyakit  infeksi menahun /kronis yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis, yang  dapat menyerang semua organ terutama  paru-paru (80%), dapat juga menyerang organ seperti pleura, selaput otak, selaput jantung, kelenjar limfe, tulang/persendihan, kulit, usus, ginjal saluran kencing, alat kelamin, dan lain-lain. Infeksi dapat bersifat silent, latent atau aktif, dengan masa pengobatan 6 sampai 8 bulan, bahkan bisa lebih dari 1 tahun. Kuman     Mycobacterium tuberculosis berpindah dari satu orang ke orang lain melalui batuk atau bersin
Sampai sekarang diagnosis laboratorik penyakit Tuberculosis  masih merupakan masalah penting di Indonesia. Diagnosis tuberculosis  secara laboratorium dapat ditegakkan dengan ditemukannya basil tahan asam (BTA)  baik melalui pemeriksaan mikroskopis, kultur atau Polimerase Chain Reacsion (PCR). BTA merupakan kuman Mycobacterium tuberculosis yang berbentuk batang lurus atau agak bengkok dan bersifat tahan terhadap penghilangan zat warna dengan asam alcohol.
Pada identifikasi  M. tuberculosis, pemeriksaan dengan media biakan lebih sensitif dibandingkan dengan pemeriksaan mikroskopis. Pemeriksaan biakan dapat mendeteksi 10 – 1000 mycobacterium/ml.
Tidak semua basil tahan asam yang  diasingkan Lowenstein-Jensen atau Ogawa adalah Mycobacterium tuberculosis. Perlu dilakukan diindentifikasi lebih lengkap untuk membedakan spesies. Dasar dari pemeriksaan identifikasi adalah waktu pertumbuhan, pembentukan pigmen, tes biokimia dan suhu pertumbuhan.
Fujiko (2002) dan Aditama (2004) menyatakan bahwa ciri-ciri utama Mycobacterium  dan kelompok MOTT (Mycobacterium other than tuberculosis) / kelompok runyon di media Ogawa adalah ada media Ogawa menunjukan sifatnya yang kering, rapuh, permukaan tidak rata, pertumbuhan eugenik dan warna kekuning – kuningan. Ketahanan asamnya ada, tingkat pertumbuhan lambat, pigmentasi lebih dari 99% negatif dan tes niasin lebih dari 90% positif.
Pemeriksaan identifikasi dengan menggunakan media Ogawa ini memberikan sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi dan dipakai sebagai alat diagnostik pada program penanggulangan TB. Identifikasi  mycobacterium  dimulai dengan menilai waktu pertumbuhan, warna pigmen, morfologi koloni dan hasil pewarnaaan BTA.
Langkah awal untuk identifikasi pada media padat adalah: Seleksi Koloni: Keberadaan satu atau lebih jenis koloni diamati. Penampilan kasar, halus cembung, halus menyebar, halus dengan tepi berkeriput, kasar transparan, kasar keruh dan sebagainya dideskripsikan; Pigmen paska inkubasi di tempat gelap (kuning, orange, kuning muda, kuning-orange) diamati. Jika tak berpigmen, sebut sebagai ”buff”;  Jika terdapat lebih dari satu jenis koloni, dilakukan subkultur untuk tiap jenis koloni dan diamati hal-hal tersebut diatas.
Pewarnaan BTA dengan Ziehl Neelsen. Meyakinkan tidak ada pencemaran. Kecepatan pertumbuhan.  Rapid grower  akan tumbuh dalam 7 hari atau kurang, sedangkan  slow grower  akan tumbuh setelah 7 hari (tidak selalu jelas batasnya); Pencahayaan Mikobakterium yang termasuk photokromogen akan menghasilkan pigmen jika dipaparkan cahaya. Namun pigmen hanya optimal jika koloni kuman terpisah. Jika pertumbuhannya sangat padat, pigmen tak akan muncul;  Dilakukan uji biokimia tertentu pada koloni murni.
Morfologi  koloni  M. tuberculosis  pada media Ogawa adalah ebagai berikut:  kasar, kering, rapuh, tengah bertumpuk dengan tepi berjejas tipis; adang-kadang tipis dan menyebar. Hari tumbuh 12    28 hari dan tidak berpigmen baik pada tempat yang terang maupun gelap (buff).
Bila terdapat  kontaminasi pada kultur, dilaporkan segera dan diulangi pembuatan kultur.  Bila kultur positif dan pertumbuhan dinilai sebagai M. tuberculosis, dilaporkan segera pada pihak yang berkepentingan. Pada minggu ke 4 dapat dibuat laporan sementara. Pada minggu ke 8 dibuat laporan akhir.
B.   Tujuan
Tujuan dalam pemeriksaan BTA dengan cara kultur dan resitensi menggunakan media ogawa 3 % adalah untuk memberikan sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi pada pemeriksaan Mycobacterium tuberculosis sehingga hasil pemeriksaan kuman Mycobacterium tuberculosis dapat terlihat dengan baik dan benar.
C.   Metode / Prinsip
Bahan sputum dipindahkan sebanyak 1 ml ke dalam tabung reaksi. dituangkan lebih kurang 4 ml larutan NaOH 4%, simpan tabung tersebut dalam inkubator pada suhu 37oC  selama 15 menit untuk melarutkan spesimen.
Kemudian diaduk  perlahan-lahan agar homogen. Dipipet 0,1 ml bahan pemeriksaan yang sudah di olah pada dua buah tabung kultur/pembiakan yang berisi madia ogawa 3%, menyebar rata di atas permukaan setiap media. Letakkan tabung-tabung pada rak miring dengan tutup yang dikendorkan.
Simpan pembenihan yang sudah ditanami pada inkubator 37oC. Tutuplah tabung dengan baik ketika permukaan media kering, kemudian inkubasi sampai sekurang-kurangnya 4 minggu.
Amati koloni yang tumbuh, Mycobacterium tuberculosis positif jika pada permukaan media terdapat pertumbuhan koloni yang berwarna kunung atau orange. Selanjutnya koloni ini digunakan untuk pemeriksaan kultur dengan menggunakan bahan uji
D.   Pembuatan Media Ogawa (Pra Analitik)
Media ogawa yang digunakan sebagai media isolasi mycobacterium tuberculosis adalah Ogawa 3 % yang terdiri dari KH2PO4, Monosedium glutamate, Gliserol malchiete green 2 % dan telur ayam segar.
1.    Larutkan zat-zat garam terlebih dahulu dan disterilkan 121 oC selama 30 menit, setelah didinginkan kemudian ditambahkan gliserol, malachiete green 2 % dan telur ayam kemudian dihomogenkan.
2.    Masukkan Campuran tersebut diatas kedalam tabung Mc Cartney 14 ml
3.    Dikoagulasikan dengan menggunakan inspirator pada suhu 85 oC selama 45 menit pada posisi miring/Slant.
4.    Diamkan sampai dingin dan simpan ditempat yang steril.
5.    Media siap untuk dipakai
E.   Alat dan Bahan
1.    Alat
-       Jas Laboratorium
-       Masker
-       Sarung Tangan (Handscund)
-       Face Shield/Goggles
-       Mikroskop
-       Inkubator
-       Bunsen
-       Rektal Swab
-       Vortex
-       Pipet
2.    Bahan
-       NaOH 4 %
-       NaCL
-       Ogawa 3 %
-       PNB
-       INH, Rif, Eth, dan Pyrazinamid (P)
F.    Cara Kerja (Analitik)
1.    Cara Kerja Kultur
-       Kumpulkan sputum penderita (sputum pagi) lakukan homogenasi dan dekontaminasi dengan Natrium Hidroksida 4%, aduk selama 2 menit. Tindakan ini dilakukan untuk membunuh kuman lain selain Mycobacterium.
-       Tambahkan NaCl fisiologis untuk pengenceran dan aduk hingga rata, biarkan 30 menit.
-       Dengan menggunakan pipet, ambil ± 2cc suspensi dan masukkan ke dalam media Ogawa 3%.
-       Inkubasi pada suhu 35ºC - 37°C dan hindarkan terkena cahaya matahari.
-       Setelah di inkubasi 5 – 7 hari, media yang telah ditanami mulai di baca dan catat hari pertama pertumbuhan koloni semenjak penanaman.
-       Jika setelah 8 minggu tidak terlihat pertumbuhan maka kultur di anggap negatif dan boleh di buang.
2.    Cara Kerja Resistensi
Untuk mendapatkan konsentrasi INH (0.1, 1.0, 5.0) dilakukan prosedur berikut
-       1 mg INH dilarutkan dalam 10 ml Aquadest steril sehingga didapatkan konsentrasi INH 100 ug/ml (larutan A).
-       INH 0.1 ug : 0.1 ml larutan A (konsentrasi 100 ug/ml) + 100 ml medium.
-       INH 1 ug    : 1 ml larutan A + 100 ml medium.
-       INH 5 ug    : 5 ml larutan A + 100 ml medium.
Untuk mendapatkan konsentrasi Rifampicin (2.0, 10.0, 50.0 ug) dilakukan prosedur berikut :
-       10 mg Rifampicin dilarutkan dalam 10 ml Aquadest steril, sehingga didapatkan konsentrasi Rifampicin 1000 ug/ml (larutan B).
-       Rif 2.0 ug   : 0.2 ml larutan B + 100 ml medium.
-       Rif 10 ug  : 1 ml larutan B + 100 ml medium.
-       Rif 50 ug    : 5 ml larutan B + 100 ml medium.
Untuk mendapatkan konsentrasi Ethambutol (1.0, 5.0, 10.0 ug/ml) dilakukan prosedur berikut :
-       10 mg Ethambutol dilarutkan dalam 10 ml Aquadest steril, sehingga didapatkan konsentrasi Ethambutol 1000 ug/ml (larutan C).
-       Eth 1.0 ug  : 0.2 ml larutan C + 100 ml medium.
-       Eth 5.0 ug  : 0.5 ml larutan C + 100 ml medium.
-       Eth 10 ug   : 1 ml larutan C + 100 ml medium.
Untuk mendapatkan konsentrasi Pyrazinamid (30, 150, 750 ug/ml) dilakukan prosedur berikut :
-       100 mg Pyrazinamid dilarutkan dalam 10 ml Aquadest steril, sehingga didapatkan konsentrasi Ethambutol 10.000 ug/ml (larutan D).
-       P 30 ug      : 0.3 ml larutan D + 100 ml medium.
-       P 150 ug    : 1.5 ml larutan D + 100 ml medium.
-       P 750 ug    : 7.5 ml larutan D + 100 ml medium.

Suspensi Kuman

Suspensi kuman di buat dengan prosedur berikut :
-       Ambil 1 o'se koloni kuman dari medium Ogawa 3% dan masukkan ke dalam NaCl fisiologis, aduk hingga homogen, hingga dicapai kekeruhan dengan standart Mc Farland I (larutan A).
-       Lakukan pengenceran 1/1000, dengan cara mengambil 0.01 ml larutan A dan masukkan ke dalam 10 ml NaCl fisiologis, sehingga didapatkan kuman dengan konsentrasi  pengenceran 1/1000 (larutan B), larutan ini akan digunakan sebagai kontrol.
-       Untuk larutan obat, digunakan suspensi kuman dengan pengenceran 1/100, di lakukan dengan cara mengambil 0.1 ml larutan A dan masukkan ke dalam 10 ml NaCl fisiologis (larutan C).
-       Pada medium kontrol, masukkan 2 tetes suspensi kuman dengan konsentrasi 1/1000 (larutan B) dan pada medium obat masukkan 2 tetes suspensi kuman dengan konsentrasi 1/100 (larutan C).
-       Lihat pertumbuhan kuman.
-       Tingkat resistensi di hitung berdasarkan perbandingan antara jumlah koloni yang tumbuh pada medium kontrol dengan medium tanpa obat (metoda proporsional).
G.   Pengamatan dan Pembacaan (Pasca Analitik)
Pada umumnya tanda pertumbuhan yang khas dari  Mycobacterium tuberculosis  akan tampak dalam waktu 3-4 minggu. Koloninya berwarna kuning muda, permukaan kering dan rapuh, dengan sudut yang tidak rata. Pertumbuhan ini disebut  eugenic. Penegasan / kepastian tentang  Mycobacterium tuberculosis harus dilakukan dengan tes identifikasi dengan media PNB.
-       Kultur diamati pada hari ke-7 untuk golongan yang tumbuhnya cepat dan pada minggu ke-4 untuk golongan yang tumbuh lambat.
-       Koloni yang tanpak pada media diperiksa dengan dibuat preparat dan diwarnai dengan Ziehl Neelsen untuk memastikan BTA.
-       Jika sudah minggu ke-4 tidak terlihat adanya koloni dilanjutkan inkubasi selama 8 minggu sebelum hasilnya dinyatakan negatif.
 H.   Pencatatan dan Pelaporan Hasil (Interprestasi)
Pelaporan dilakukan bukan hanya jumlah koloni yang tumbuh, tetapi juga bentuk tumbuhnya. Menurut (Aditama & Luthni ,2002) pelaporan hasil biakan menurut WHO, Technic Guide 67 adalah :
(-)             : tidak ada pertumbuhan
(1+)           : 1 – 200 koloni
(2+)           : ½ dari media tertutup oleh 200 – 500 koloni
(3+)           : ¾ dari media tertutup oleh hampir   seluruh koloni, 500 – 2000 koloni
(4+)           : media tertutup seluruhnya oleh koloni, lebih dari 2000 koloni
I.      Kesimpulan
1.    Sampai sekarang diagnosis laboratorik penyakit Tuberculosis  masih merupakan masalah penting di Indonesia. Diagnosis tuberculosis  secara laboratorium dapat ditegakkan dengan ditemukannya basil tahan asam (BTA)  baik melalui pemeriksaan mikroskopis, kultur atau Polimerase Chain Reacsion (PCR).
2.    Pemeriksaan identifikasi dengan menggunakan media Ogawa ini memberikan sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi dan dipakai sebagai alat diagnostik pada program penanggulangan TB.
3.    Salah satu kendala dalam diagnosis pasti tuberkulosis adalah lamanya waktu untuk kultur atau pembiakan kuman tuberkulosis secara konvensional seperti biasa dilakukan sekarang ini. Dalam perkembangan ada beberpa teknik baru yang dapat mengidentifikasi pasti kuman tuberkulosssis secara lebih cepat. Salah satunya yaitu reaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR).
4.    Pemeriksaan kultur sangat dibutuhkan untuk memastikan diagnosis pada kasus hasil apusan dahak negatif. Metode tradisional yang biasa digunakan yaitu menggunakan medium padat seperti Lowenstein-Jensen dan Ogawa. Namun terdapat bukti yang menunjukkan bahwa pertumbuhan bakteri di medium padat pada umumnya lebih lambat dan kurang sensitif dibandingkan medium cair sehingga dikembangkanlah sistem medium cair seperti BACTEC dan MGITT